Наборы для ПЦР-диагностики и вакцины от COVID-19 необходимы для борьбы с пандемией. Одна из самых больших проблем, связанных с их хранением, транспортировкой и использованием – необходимость охлаждения или замораживания материала. Эта холодильная цепочка (завязанная на охлаждении наборов от этапа производства и до этапа хранения и использования), делает диагностику и вакцинацию особенно трудными в местах, где нет подходящей инфраструктуры и возможности для хранения. В этом посте я рассматриваю использование метода лиофильной сушки как возможное решение проблемы холодильной цепи.

Все мы помним палящую жару в Москве и в других регионах России этим летом. Да, для наших широт такая жаркая погода непривычна, но на Земле есть места, в которых подобный зной царит регулярно. И им приходится иметь дело с множеством проблем, гораздо худших, чем мороженое, которое тает уже в упаковке.

Возьмите нынешнюю пандемию Covid-19. Диагностические наборы для ПЦР и вакцины часто необходимо охлаждать или даже замораживать во время транспортировки и хранения. В жарком климате и в местах, где отсутствует необходимая инфраструктура для поддержания низких температур, чтобы хранить эти медицинские препараты, может быть очень сложно провести вакцинацию или тестирование населения.

Один из способов решения этой проблемы – избежать необходимости охлаждения или замораживания диагностических наборов и вакцин. Преодоление необходимости поддерживания холодильной цепочки, повышение стабильности вакцин и диагностических наборов для ПЦР может быть достигнуто с помощью сублимационной сушки или лиофилизации . Если вы следите за блогом, то знаете, что сублимационная сушка – один из моих любимых процессов , поэтому я воспользуюсь возможностью обсудить с вами, как мы можем использовать его применительно к наборам для ПЦР-диагностики COVID-19 и других заболеваний.

Но прежде, чем я перейду к части о лиофильной сушке, позвольте мне кратко рассказать вам о том, как работают диагностические ПЦР-наборы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод in vitro для быстрого синтеза больших количеств определенного сегмента ДНК. Во время этого процесса ДНК копируется и становится субстратом для дальнейшей репликации. Идентифицируя реплицированный материал, можно описать целевую ДНК. В случае диагностических ПЦР-наборов, если образец содержит интересующую ДНК, скажем, вируса или бактерии, то происходит репликация, и результат ПЦР является положительным.

И я могу утверждать, что лиофилизация дает больше преимуществ, чем необходимость поддержания холодильной цепи для диагностических ПЦР-наборов и вакцин. Поскольку в процессе лиофилизации удаляется вода, как участник реакции, сублимационная сушка может повысить стабильность и срок хранения продуктов. Лиофилизация подходит для обработки термочувствительных продуктов, а также продуктов, чувствительных к кислороду, поскольку она может осуществляться в инертной атмосфере. Поскольку лиофильная сушка создает высокопористый сухой продукт, то в качестве дополнительного бонуса вы можете рассчитывать на быстрое восстановление субстрата к исходному состоянию.

Что касается диагностических ПЦР-наборов, сублимационная сушка имеет следующие преимущества:

• в то время как срок годности жидких диагностических наборов для ПЦР в холодильнике или морозильнике составляет 6 месяцев, лиофилизированные наборы могут оставаться стабильными при 30 °C более года;
• поскольку не требуются циклы замораживания-оттаивания, отсутствуют потери активности компонентов;
• этот метод уменьшает проблемы, связанные с поддержанием холодильной цепочки, а также проблемы с упаковкой
• лиофилизированный мастер-микс набора для ПЦР подготовлен заранее – набор не только содержит все необходимые компоненты, но с его помощью повышается эффективность и воспроизводимость, в результате чего можно избежать контаминации и ошибок при пипетировании.

Сублимационная сушка фармацевтических продуктов, в том числе диагностических ПЦР-наборов, представляет собой многоступенчатый процесс:

Давайте пройдемся по этим пяти стадиям, и я дам вам несколько советов по их оптимизации для фармацевтических применений.

1. Пробоподготовка – выберите контейнер, подходящий для вашего образца. Учитывайте термические и химические свойства активного компонента в вашем образце. Обратите внимание на то, какая температура замерзания необходима, и является ли ваш активный фармацевтический ингредиент (АФИ) чувствительным к рН. Убедитесь, что любой растворитель, присутствующий в вашем образце, может замерзнуть при данной концентрации. Не забывайте добавлять вспомогательные вещества, такие как объёмообразующие агенты, для стабилизации структуры в случае растворов с низким содержанием твердых веществ, или модификаторы температуры разложения, чтобы увеличить температуру хранения для более безопасной и быстрой сублимации ваших диагностических ПЦР-наборов.

2. Замораживание – на этой стадии необходимо сделать образца твердым. Формирование кристаллов льда здесь зависит от скорости и температуры замораживания. Размер образующихся кристаллов влияет на скорость сублимационной сушки и пористость конечного продукта.

Как показывает практика, чем меньше размер кристалла льда, тем больше время процесса.

Важно отметить, что изменение концентрации при замерзании из-за образования льда может привести к изменению pH и последующим конформационным и структурным превращениям. Кристаллы льда могут оказывать механическое воздействие на активные компоненты, включая повреждение клеточных или белковых мембран. Чтобы решить эту проблему, вы можете попробовать использовать криопротектор.

3. Первичная сушка – когда у вас есть замороженные образцы, вы можете переходить к первичной сушке. На этом этапе вам необходимо поддерживать низкую температуру образца даже во время загрузки партии в лиофильную сушилку . Это необходимо для предотвращения разрушения из-за высокого содержания воды в замороженных образцах. Чтобы оптимизировать время сушки, вам также следует отслеживать процесс сублимации, используя методы определения конечных точек. Вы можете либо проверять изменение температуры образца, либо отслеживать изменение давления, которое зависит от количества сублимированного пара в сушильной камере.

По завершении этапа первичной сушки остаточная влажность в диагностических ПЦР-тестах может составлять около 5-10%.

Я также хочу добавить, что вы можете добиться точного и эффективного потребления энергии для сублимации путем контроля:

• нагревания полки сублимационной сушилки (кондуктивный теплообмен);
• конвективной теплопередачи;
• более высокого уровня вакуума в зависимости от температуры плавления/коллапса;
• сведения к минимуму неактивной энергии через излучение, энергии беспорядочного движения, чтобы уменьшить влияние на воспроизводимость процесса.

Во время первичной сушки важно найти хороший баланс между эффективной сублимацией и стабильной структурой замороженного образца, приложив необходимую энергию к фронту сублимации.

Для диагностических ПЦР-наборов в 96-луночных форматах существует лишь небольшая поверхность контакта между образцом и полкой сублимационной сушилки. Чтобы попытаться решить эту проблему, вы можете попробовать использовать алюминиевые блоки, чтобы максимизировать теплоотдачу от полки.

4. Вторичная сушка – вы можете приступить к вторичной сушке, как только при первичной сушке сублимируется весь лед. Эта фаза основана на десорбции остаточного льда, такого как кристаллическая вода в образце. Вы можете установить температуру полки до 50 °C. При настройке температуры учитывайте тепловые характеристики, такие как температура разложения «сухого» образца.

По окончании вторичной сушки конечное содержание влаги в образце должно быть в диапазоне 1-3% для диагностических ПЦР-тестов.

5) Дальнейшая обработка – после завершения всех этапов сушки вам необходимо запечатать продукт во влагонепроницаемом контейнере для хранения и транспортировки. Если вы хотите сначала провести контроль качества продукции, конечную влажность можно определить с помощью титрования по Карлу-Фишеру.

Надеюсь, вы не перегрелись от всей этой информации и сумели сохранить хладнокровие. Это интересная тема, и я мог бы писать о ней целую вечность, но на этом я остановлюсь и для получения дополнительной информации приглашаю вас посмотреть вебинар, где в дискуссии примут участие специалисты компании, производящей лиофилизированные ПЦР-тесты.

Мне было очень приятно сегодня еще раз обсудить с вами лиофилизацию. Я мог бы попытаться делать это чаще. Оставайтесь с нами, и вы увидите, смогу ли я сделать это.

До новых встреч,