На данный момент вам хорошо известно, что разрешение – это важная способность колонки разделять два или более соединения в процессе хроматографии. Я уже обсуждал, как селективность и коэффициент эффективности колонки влияют на разрешение. Теперь я продолжу эту тему и рассмотрю, как размер частиц, наполнение колонки и размер пор влияют на эффективность колонки. Кроме того, я поделюсь с вами информацией о том, как вы можете отрегулировать эти параметры для достижения максимальной чистоты целевых соединений.

Поклонники этого блога уже в курсе моих главных увлечений. Это хроматография, лиофилизация, кулинария и спорт. Если чемпионат мира по футболу не предвидится в ближайшее время, то чемпионат мира по хоккею в прошлом месяце доставил мне огромное удовольствие.

До начала чемпионата я беседовал с коллегой о фаворитах предстоящего турнира. Она была абсолютно уверена, что победу одержит российская команда. Эту уверенность ей внушали исключительно высокий рост и огромная сила мышц игроков. Она даже не сомневалась в том, что русские спортсмены будут доминировать над всеми своими противниками. Однако в финале победила финская команда, доказав, что не только физические данные  важны для победы.

Если в хоккее размер – это не самый важный параметр, то есть одна интересная область, для которой выбор правильного размера, безусловно, увеличивает шансы на успех. Вы, конечно, можете спросить, что это за область? Но не думаю, что ответ будет для вас сюрпризом. Несомненно, это хроматография!

Пару статей назад я познакомил вас с эффективностью колонок и их влиянием на хроматографическое разрешение. Я обещал вам, что чуть позже расскажу, как улучшить коэффициент эффективности, и вот сейчас я выполняю это обещание.

Чтобы понять, как можно повлиять на эффективность колонки, давайте рассмотрим еще одно базовое уравнение для хроматографии, аппроксимирующее уравнение Ван-Деемтера:

Это уравнение четко показывает, что высота теоретической тарелки (H) а, следовательно, и количество тарелок (N) в колонке определяются в основном двумя факторами. Этими параметрами являются: диаметр частиц неподвижной фазы (dp) и линейная скорость потока подвижной фазы (u).

Давайте рассмотрим графически, как можно определить оптимальную высоту тарелки (H₀) для неподвижных фаз, имеющих разные размеры частиц, используя уравнение Ван-Деемтера:

В отличие от хоккея, для которого предпочтительны большие размеры, наш коэффициент эффективности выиграл бы больше от меньших размеров частиц. Из приведенного выше графика, очевидно, что высота теоретической тарелки прямо пропорциональна размеру частиц. Таким образом, чем мельче адсорбент, тем меньше высота теоретических тарелок и выше эффективность колонки.

Таким образом, уменьшение размера частиц является способом повышения эффективности колонки для достижения лучшего разделения.

К сожалению, маленький размер частиц сопряжен с очевидным недостатком: чем меньше размер частиц, тем большее давление требуется для проталкивания подвижной фазы через колонку. Давление, необходимое для оптимальной линейной скорости, увеличивается обратно пропорционально квадрату диаметра частиц. Это значит, что

переходя на адсорбент, размер частиц которого в 2 раза меньше, чем у предыдущего, при условии, что длина колонки остается прежней, следует ожидать, что производительность увеличится в два раза, а требуемое давление при этом возрастет в четыре раза.

Однако существует практический предел размера частиц.

Возвращаясь к аналогии с хоккеем, следует отметить, что антропологические особенности помогают игрокам побеждать в хоккейных играх, но другие факторы, такие как стратегия, подготовка, экипировка, состояние здоровья, также влияют на исход игры. Эффективность колонки тоже зависит от размера частиц, но другие параметры, такие как размер пор и наполнение колонки, оказывают не меньшее влияние на эффективность, и конечный результат очистки.

Рассмотрим наполнение колонки. Колонка может быть эффективной, только если она правильно заполнена, независимо от того, какой адсорбент используется. Если неподвижная фаза заполняет колонку неравномерно, траектории движений растворенных молекул могут различаться по длине внутри колонки. По этой причине растворенные молекулы, входящие в колонку одновременно, будут выходить из нее с различным интервалом. В результате будет наблюдаться расширение пика.

При правильном наполнении колонки адсорбентом траектории движения растворенных молекул внутри колонки имеют очень близкие значения длины, что приводит к более узким пикам.

Сферическая форма частиц неподвижной фазы гарантирует однородное заполнение колонки и чаще всего устраняет эффект расширения пика.

Другой важный параметр, имеющий непосредственное отношение к колонке и ее эффективности, – это размер пор неподвижной фазы.

Маленькие поры обеспечивают большую площадь доступной удельной поверхности, а поры большого размера способствуют лучшему разделению более крупных молекул. Например, если размер белка немного меньше размера поры, то молекула белка может проникнуть внутрь поры, но покинуть ее уже будет нелегко. И если размеры пор явно недостаточны для разделяемого аналита, то время удержания, эффективность колонки и коэффициент емкости заметно снижаются.

Это означает, что для достижения правильной формы пика важно подобрать размер пор адсорбента. Слишком маленький размер пор, так же, как и слишком большой, приводит к размыванию пика и плохому разрешению.

Кроме того, имейте в виду, что если у вас есть ограничения по применению давления, очень маленький размер частиц неподвижной фазы может привести к движению с меньшей скоростью, чем оптимальная линейная скорость. В таком случае использование более длинной колонки, заполненной более крупными частицами, будет для вас куда более оптимальным решением. По сути, вы должны находить компромисс между размером частиц адсорбента, длиной колонки, скоростью потока, временем цикла и давлением.

А сейчас давайте снова посмотрим на уравнение разрешения:

На практике изменение числа теоретических тарелок N (например, двукратное увеличение) обычно не оказывает значительного влияния на разрешение двух пиков. Это связано с тем, что разрешение прямо пропорционально только квадратному корню из числа теоретических тарелок. Следовательно, удвоение параметра N будет означать и удвоение времени анализа, но при этом  разрешение увеличится всего лишь в 1,42 раза, что равно квадратному корню из 2. Определенно, вы должны оптимизировать эффективность колонки для гарантированного разделения вашего сложного образца, но имейте в виду следующее:

изменение размера частиц неподвижной фазы в определенной степени улучшает разрешение, но в целом вы можете добиться гораздо лучших результатов, если сначала оптимизируете селективность.

Я уже посвятил теме селективности две статьи моего блога, поскольку селективность в хроматографии чрезвычайно важна для разрешающей способности. Читайте, как выбор подвижной и неподвижной фазы влияет на селективность и используется для улучшения разрешения при проведении хроматографического разделения. Надеюсь, что с правильной стратегией, хорошими навыками и оборудованием вы сможете стать чемпионами в области хроматографии.

До новых встреч,