Вы наверняка знаете, что в вашем образце скрыто множество соединений. Вы знаете, что ваш цикл хроматографии настроен на оптимальное разделение. А вы думали о своем методе детекции? Вы уверены, что сможете распознать всё, что для вас важно, в полученных фракциях? В этом посте я представлю пять различных детекторов: УФ, ELSD, МС, рефрактометрический и флуоресцентный, расскажу об их преимуществах и ограничениях и упомяну о том, какие соединения лучше всего подходят для каждого детектора.

Моя сестра и ее семья были у нас в гостях в прошлую субботу, и мы провели вечер, ломая голову над криминальной головоломкой. Когда мы собрали все части воедино, нужно было найти улики и раскрыть преступление. Это заняло у нас около трех часов, но нам удалось найти виновного. Одним из виновников того, что мы так долго провозились, был я сам, поскольку меня отвлекла ультрафиолетовая лампа, которая прилагалась к головоломке для поиска секретных сообщений на картинке. Меня никогда не перестает удивлять, что что-то может где-то присутствовать, но быть невидимым невооруженным глазом.

Где это может быть более очевидно в лаборатории, чем в хроматографии с ее различными детекторами? Так, у вас есть образец, полный огромного количества различных соединений. Но только когда вы пытаетесь его фракционировать, вы с болью осознаете, что, возможно, видите только половину картины!

Я уже затрагивал тему методов обнаружения ранее, в основном сосредоточив внимание на преимуществах и ограничениях УФ-детекции, детекции по светорассеянию растворенного образца (ELSD) или УФ и ELSD-детекции, используемых в комбинации. Я хотел бы освежить вашу память об этих детекторах, а также познакомить вас с тремя другими часто используемыми методами обнаружения в жидкостной хроматографии.

Давайте начнем с методов детекции, с которыми мы уже должны быть знакомы.

УФ-детекторы

Это наиболее часто используемые детекторы в препаративной хроматографии. Этот метод обнаружения является селективным, так как может использоваться только для измерения веществ, поглощающих свет в ультрафиолетовом диапазоне (200-400 нм) или видимом диапазоне (400-800 нм). Вещества, которые можно успешно наблюдать с помощью УФ-детектора, содержат хромофорную группу, например:

• Ароматическое кольцо
• Две сопряженные двойные связи
• Двойную связь, примыкающую к атому с одной электронной парой
• Карбонильную группу
• Бром, йод или серу.

УФ-детектор в используемой вами хроматографической системе определяет изменение интенсивности пучка ультрафиолетового света, проходящего через раствор. Поглощение света связано с концентрацией раствора, через который проходит луч света. Эта зависимость описывается законом Ламберта-Бера:

где:

E = Экстинкция [безразмерная]
ε = Коэффициент экстинкции [M–1· cm–1]
c = Концентрация раствора [моль/л]
d = Длина пути луча света через раствор [см]

Каждый растворитель, который вы используете, имеет характерную длину волны отсечки УФ-поглощения. При длинах волн, которые ниже этого значения, растворитель сам поглощает весь свет.

При использовании УФ-детектора следует выбирать растворитель, который не имеет значительного УФ-поглощения на длине волны, на которой будут проводиться измерения. В противном случае сигнал вещества и растворителя будут перекрываться, что приведет к неправильному фракционированию.

Если вы не располагаете информацией о спектре поглощения вашего соединения, я бы рекомендовал вам использовать несколько длин волн одновременно или даже детектор с диодной матрицей (ДМД), который может регистрировать весь УФ-спектр. Полученный график предоставит пользователю больше информации:

В заключение обзора метода УФ-детекции я хотел бы остановиться на нескольких его преимуществах. УФ-детекторы просты в использовании, надежны, относительно недороги, совместимы с градиентами растворителей, не разрушают образец, и относительно чувствительны и точны. Недостатки метода УФ-детекции заключаются в том, что соединения, не обладающие эффективной хромофорной группой, трудно обнаружить, а растворители ограничены УФ-отсечкой, особенно при низких длинах волн УФ-излучения.

ELSD

ELS-детекторы используют для анализа количество света, рассеянного частицами растворителя, высушенного путем испарения. Процесс состоит из трех этапов: распыление, испарение растворителя и детекция. При распылении небулайзер объединяет газовый поток воздуха или азота с потоком из колонки или картриджа, в результате чего образуется аэрозоль из мельчайших капель. На втором этапе капли попадают в пролетную трубку, где подвижная фаза испаряется и оставляет частицы целевого соединения. На последнем этапе свет попадает на высушенные частицы, выходящие из трубки. Свет рассеивается, и полученные фотоны регистрируются фотодиодом.

Математическое уравнение, описывающее метод ELSD, зависит от размера частиц:

A = am^b

где A- площадь пика
m — масса растворенного вещества
a и b — константы, которые зависят от множества факторов, таких как размер частиц, концентрация и тип целевых веществ, скорость потока газа, скорость потока подвижной фазы и температура пролетной трубки.

Методика ELS-детекции идеально подходит, если вы хотите очистить соединения, не содержащие хромофорной группы. Это именно те соединения, которые не могут быть легко обнаружены с помощью УФ-детектора. К таким соединениям относятся углеводы, липиды, жиры и полимеры.

Функционирование ELS-детектора не нарушается при изменении подвижной фазы и смещении базовой линии градиента. Чувствительность метода ELS не зависит от физических и химических свойств соединения и определяется только абсолютным количеством соединения. Поскольку ELSД является масс-зависимым детектором, высокий сигнал указывает на то, что элюируется большое количество соединения. Благодаря тому, что детектор является полуколичественным, с его помощью можно получить ценную информацию о соотношении соединений в образце.

Метод ELSD позволяет обнаружить практически все соединения, за исключением сильно летучих аналитов, например, этанола в вине. Как правило, интересующее вас соединение или добавляемый модификатор должны быть менее летучими, чем подвижная фаза. Кроме того, метод ELSD разрушает образец, поэтому следует стремиться использовать небольшие объемы образца.

Чем ниже температура кипения подвижной фазы, тем легче испаряется растворитель. Подвижные фазы с высокой температурой кипения, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА), толуол или воду, необходимо упаривать при высоких температурах. Однако такой подход сопряжен с риском разрушения целевых соединений. В качестве альтернативы растворители могут быть распылены на очень мелкие капли, что позволяет упаривать их даже при комнатной температуре.

Теперь давайте рассмотрим некоторые методы обнаружения, которые мы еще не затрагивали в блоге.

Масс-спектрометрия (МС)

Масс-спектрометр, как хроматографический детектор, позволяет идентифицировать соединения на основе каждого хроматографического пика по его уникальному масс-спектру. Система жидкостной хроматографии в сочетании с МС-детектором имеет следующий алгоритм работы. Сначала молекулы преобразуются из хроматографического элюента в заряженное или ионизированное состояние. Масс-анализатор — это компонент масс-спектрометра, который принимает ионизированные массы и разделяет их на основе отношения заряда к массе. Затем анализатор передает их на детектор, где они распознаются и преобразуются в цифровой сигнал.

К преимуществам МС-детектора относятся хорошая чувствительность, селективность и возможность получения структурной информации. Недостатками МС-детектора являются цена покупки и необходимость частого обслуживания прибора. По моему мнению, МС-детектор не имеет смысла использовать в обычно людной и занятой лаборатории синтеза.

Рефрактометрия (RI)

Рефрактометрический детектор определяет изменения в преломлении света, вызванные средой, когда она проходит через измерительную кювету. Этот метод обнаружения является неизбирательным, поскольку он определяет все вещества, проходящие через кювету. Рефрактометрические детекторы производят измерения в соответствии со следующим принципом:

∆n= Разница между показателями преломления
nG = Показатель преломления растворенного образца
nL = Показатель преломления чистого растворителя
ni = Показатель преломления образца
c = Концентрация образца

Преимущества метода определения RI включают:

• Универсальный характер отклика детектора
• Хороший линейный динамический диапазон — ~4 порядка величин
• Простота эксплуатации

Ограничения метода определения RI включают:

• Невозможность использования с градиентами растворителя
• Низкая чувствительность
• Очень чувствителен к колебаниям температуры и давления

Флуоресцентный детектор

Когда соединения со специфическими функциональными группами возбуждаются энергией более короткой длины волны, они испускают излучение более высокой длины волны или флуоресценцию. Интенсивность флуоресценции зависит как от длины волны возбуждения, так и от длины волны излучения, что позволяет селективно определять одни компоненты относительно других. Около 15% всех соединений обладают естественной флуоресценцией.

Алифатические и алициклические соединения с карбонильными группами и соединения с сильно сопряженными двойными связями обладают естественной флуоресценцией. Ароматические компоненты с сопряженными пи-электронами дают самую сильную флуоресцентную активность.

К основным преимуществам флуоресцентных детекторов относят:

• Высокую чувствительность — чувствительность флуоресцентных детекторов в 10 — 1000 раз выше по сравнению с УФ-детекторами
• Высокую селективность
• В целом, нечувствительность к потоку и изменению температуры

Недостатки метода флуоресцентного детектирования включают:

• Ограниченную линейность
• Не так уж много соединений обладают естественной флуоресценцией
• Метод дериватизации достаточно сложен
• Сложное использование детектора — необходимо иметь четкое представление о химических и инструментальных переменных
• Некоторые химические вещества, такие как кислород, могут гасить флуоресценцию — необходимо соблюдать особую осторожность при дегазации.

Вот и все! Пять методов детектирования, которые должны помочь идентифицировать любое соединение в вашем образце. По этой теме всегда можно получить больше информации, поэтому я приглашаю вас посмотреть бесплатный вебинар по методам обнаружения или прочитать бесплатную Энциклопедию по хроматографии Chromapedia с более подробной информацией, включая множество таблиц растворителей с соответствующими свойствами.

Фух, я не могу больше заниматься детектированием, в отличие от моих коллег из блога “Шалот Холмс и пищевые сыщики”, где они вынуждены раскрывать дела по анализу продуктов питания как минимум два раза в месяц! Но эй, меня ведь зовут не Барт Холмс, а Бирке — не Ватсон. Но она могла бы им стать! Посмотрите наш последний документально зафиксированный обмен мнениями для всех, кто интересуется моей личной и научной лабораторией, в последней записи блога, посвященной четвертому дню рождения блога Барта. Приятного чтения!

До новых встреч,