Очистка пептидов или белков – один из наиболее часто используемых методов в любой медико-биологической лаборатории. Удивительно даже, что я никогда раньше не обращался к этой теме, и я хотел бы исправить свою ошибку. В этом посте я объясню роль хроматографии в очистке белка и дам вам советы, как выбрать правильную неподвижную фазу.

На прошлой неделе погода была очень приятной, поэтому мы с женой собирались погулять после обеда в парке. Одно из самых оживленных мест в нем – открытый тренажерный зал, где люди могут заниматься спортом на свежем воздухе. Большинство из них находятся в хорошей форме, вытворяя своими мышцами удивительные вещи. И я заметил, что помимо плееров и полотенец, одним из самых распространенных предметов в их руках был протеиновый коктейль.

И вот мои мысли, естественно, перенесли меня в чудесный мир белков. Я имею в виду, что белки и пептиды, их собратья поменьше, отвечают за многие жизненно важные функции, такие как передача сигналов, регулирование сердцебиения, прием пищи и рост. Помимо их важности в бодибилдинге, они находят применение в биотехнологиях, биоинженерии, разработке и доставке лекарств, косметике и питании. Так почему же, черт возьми, я писал о косметике , но никогда раньше не посвящал посты очистке белков?

Это нужно исправить прямо сейчас!

Белки можно разделить с помощью кристаллизации, фильтрования и осаждения, но одним из наиболее распространенных методов очистки белков служит хроматография. Виды хроматографии, используемые при работе с белками, включают:

Type of liquid chromatography	Mode of separation based on:	Applications & remarks	Pros & cons
Ion chromatography	Charge	Peptides Proteins	Mild conditions, no denaturation of the compounds, but low resolution
Affinity chromatography	Specific binding interaction	Proteins	High purity but tag interferes with structure of the protein
Size exclusion chromatography	Molecular sizes	Proteins	Simple and high preservation of the compound's activity, but high dilution and low resolution
Adsorption chromatography (reversed-phase)	Hydrophobicity	Peptides Proteins (small and stable)	High purity, but denaturation of the compounds

Среди этих методов обращенно-фазовая хроматография является явным фаворитом для очистки небольших белков и разделения пептидов. Это во многом связано с высокой разделяющей способностью метода, который позволяет эффективно разделять полипептиды, отличающиеся даже всего одной аминокислотой. В этом методе в качестве подвижных фаз используются полярные органические растворители. Они ограничивают применимость метода пептидами и небольшими стабильными белками, которые могут самопроизвольно восстанавливать конформацию после очистки. Кроме того, обращенно-фазовая хроматография широко используется и для обнаружения примесей в ходе исследовательских работ или для удаления нежелательных соединений во время очистки больших партий терапевтических препаратов.

Если вы решите использовать обращенно-фазовую хроматографию для очистки белков, вы можете выбрать между флэш-хроматографией или препаративной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией).

Флэш-хроматография часто используется в качестве стадии предварительной очистки для выделения больших количеств образцов с удовлетворительным разрешением. Препаративная ВЭЖХ используется для получения наивысшего разрешения и чистоты целевых веществ, но имеет ограничение из-за более низких загрузок.

Эти две методики различаются материалом, используемым для неподвижной фазы, в том числе размером частиц, размерами картриджа или колонки и скоростью потока подвижной фазы. Ниже в таблице приведены различия:

	Flash	Prep HPLC
Particle size	15 - 63 µm	5 - 15 µm
Column ID	12 - 115 mm	10 - 70 mm
Flow rate	15 - 250 mL/min	5 - 100 mL/min
Loading capacity	< 300 g	< 10 g
Max pressure	50 bar	300 bar

Выбор между a системами флэш-хроматографии или препаративной ВЭЖХ для очистки белка зависит от образца и конкретных потребностей. Большинство биохимиков используют флэш-хроматографию в качестве первого шага для получения как можно большего количества предварительно очищенного целевого соединения. Затем они чистят собранные фракции, уже меньшего объема и отделенные от большинства примесей, с помощью препаративной ВЭЖХ для достижения необходимого высокого разрешения.

Как подобрать идеальную неподвужную фазу для очистки белка?

Выбранная вами неподвижная фаза должна удерживать целевое соединение, но не слишком сильно и не слишком слабо. Если неподвижная фаза связывается слишком слабо, соединение будет проходить через колонку с фронтом подвижной фазы и, вероятно, не сможет отделиться от других соединений в смеси. Если неподвижная фаза связывается слишком сильно, потребуется слишком много времени и растворителя для элюирования целевого соединения.

Существует шесть параметров, которые влияют на удержание, и сейчас я вам последовательно расскажу о них. Вы можете ознакомиться с одной из моих предыдущих публикаций в блоге, посвященной удерживанию , чтобы узнать больше.

1. Полярность – если соединение не взаимодействует с неподвижной фазой, его нельзя отделить от других хроматографически. Вещество должно быть совместимо с растворителями, используемыми для приготовления подвижной фазы. Взгляните на таблицу ниже, чтобы увидеть список распространенных полярных и неполярных неподвижных и подвижных фаз.

Type of adsorption chromatography	Polarity stationary phase	Polarity solvents	Common solvents
Normal phase (unbonded silica)	Polar	Unpolar	hexane/ethyl acetate or dichloromethane/methanol
Reversed phase (bonded silica, such as C18, C8, C4)	Unpolar	Polar	mixtures of water and a second water-miscible solvent, such as methanol, acetonitrile or ethanol

2. Размер частиц – меньшие размеры частиц силикагеля в картридже или колонке приводят к более высокой общей площади поверхности, что, в свою очередь, увеличивает количество возможных стадий адсорбции и десорбции. Это приводит к повышению эффективности колонки, более высокому разрешению и чистоте.

3. Форма частиц – сферические частицы имеют более равномерную упаковку в колонке или картридже, поэтому помогают достичь большей однородности потока, чем частицы неправильной формы. Сферические частицы обеспечивают более острую форму пика и лучшее разрешение.

4. Содержание углерода – это свойство относится к углеводородам, ковалентно присоединенным к силикагелю. Более высокое содержание углерода приводит к более высокому разрешению, но также к увеличению времени разделения.

5. Размер пор – как показывает практика, размер пор должен быть как минимум в три раза больше диаметра молекулы. Если диффузия целевого соединения в структуру пор затруднена, разрешение снижается.

6. Площадь поверхности – площадь поверхности частиц силикагеля равна сумме их внутренней и внешней поверхностей. На это свойство влияет размер частиц и размер пор. Чем больше площадь поверхности, тем выше разрешение.

Для очистки белка вам нужно в первую очередь обращать внимание на полярность фаз, размере частиц и размере пор.

Я бы порекомендовал использовать частицы небольшого размера, поскольку это позволит разделить даже очень похожие соединения. Выбранная стационарная фаза обычно представляет собой фазу модифицированного силикагеля, такую как C18, C8 или C4, которые различаются длиной алкильных цепей, связанных с остатками силанольных групп. Фаза C18 более неполярна и гидрофобна, чем C8 и C4, поэтому пептиды и белки с более высокой гидрофобностью сильнее взаимодействуют с этой неподвижной фазой. Полярные молекулы лучше удерживаются фазами C4.

Типичные растворители, используемые для очистки белков, — это вода и менее полярные растворители, такие как ацетонитрил, изопропанол или этанол.

Наиболее часто используемым растворителем служит ацетонитрил: он летуч, легко удаляется из собранной фракции, имеет низкую вязкость и низкое поглощение УФ-излучения. Для разделения пептидов традиционно используется трифторуксусная кислота (ТФК), добавляемая в подвижную фазу в концентрациях около 0,1 %. Для получения более острых пиков при самом высоком разрешении я бы порекомендовал вам сформировать градиент, при котором вы медленно увеличиваете концентрацию менее полярного растворителя.

Имейте в виду, что более полярные молекулы элюируются первыми.

Что касается неподвижной фазы, силикагели со стандартными порами размером 60-100 Å подходят только для молекул меньшего размера. Более крупные белки не могут проникнуть в мелкие поры, что уменьшает площадь поверхности для разделения и приводит к низкому разрешению. Для крупных белков требуются поры большего размера — в диапазоне 200–300 Å. Взгляните на рисунок ниже, который поможет вам выбрать неподвижную фазу на основе полярности и молекулярной массы вашего целевого белка и пептида:

Очистка белков оказалась интересной темой, поэтому, возможно, я немного увлекся своими объяснениями. Я надеюсь, что этот пост был протеиновым коктейлем скорее для вашего мозга, чем для ваших мышц, и вы сочли его полезным. Я уверен, что вернусь к этой теме в будущем. Как вы думаете, это необходимо? Оставляйте мне свои комментарии ниже! И если вы хотите получить еще больше информации, ознакомьтесь с моими постами о выборе неподвижных и подвижных фаз чем раньше, тем лучше.

До новых встреч,