В последнее время пептиды и белки пользуются всё большей популярностью в области биотехнологии. Не так давно я посвятил свой пост очистке белков, но понял, что оставил тему получения белков несколько незавершенной. В этом посте я рассмотрю шаг, следующий после очистки, – стадию концентрирования белка, в основном сосредоточившись на двух обычно используемых методах: ротационном упаривании и лиофильной сушке.

Моя сестра в последнее время была очень занята работой, поэтому я пытался поддержать ее, отвозя каждое утро племянника в школу. Возвращаться домой же ему приходится одному, и теперь, когда становится теплее, он предпочитает использовать вместо автобуса другие виды транспорта. Несколько дней назад утром мы несколько минут простояли в гараже, размышляя, стоит ли взять с собой его велосипед, роликовые коньки, скутер или лонгборд для дороги домой. Каждый из них имел различные преимущества с точки зрения скорости, веселья, крутизны и так далее, и все они помогали достичь одной и той же цели – вернуться домой из школы.

Конечно, обычная жизнь и жизнь в лаборатории имеют много общего. Часто существует несколько способов достижения плюс-минус одного и того же результата. Примеры бесконечны, но я думаю, что, поскольку я недавно обсуждал с вами очистку белков, эта тема все еще остается у меня в голове. Позвольте мне показать вам, помимо различных средств перемещения, различные способы концентрирования белка.

Как мы уже обсуждали ранее, пептиды и белки принадлежат к одному из четырех основных классов макромолекул, встречающихся в природе. Белки, состоящие из аминокислот, и пептиды, состоящие из меньшего числа аминокислот, играют важную роль почти во всех фундаментальных процессах в живых клетках.

В биомедицинских или биохимических исследованиях пептиды и белки часто изучаются на предмет их потенциала в качестве терапевтических препаратов. Эти биомолекулы можно использовать в качестве эталонов в количественных исследованиях, факторов роста и цитокинов для клеточных культур, активных ферментов для биохимических анализов, белков-носителей для перемещения молекул, ингибиторов для блокирования путей или антигенов для использования с антителами.

Белки и пептиды можно получать путем химического синтеза с использованием рекомбинантных микроорганизмов или бесклеточных систем экспрессии, или путем экстракции из их естественной среды. Выделение белков после того, как они были синтезированы, является решающим шагом. И здесь появляется выбор. Вы можете выполнить этап концентрирования белка с помощью любого из следующих методов: распылительной сушки, ротационного упаривания, параллельного упаривания или лиофильной сушки.

В этом посте я хотел бы сосредоточиться на двух наиболее часто используемых методах концентрирования белка: ротационном упаривании и лиофильной сушке.

Ротационное упаривание для концентрирования белков

Если вы читаете этот блог, то знаете, что ротационные испарители удаляют растворители из пробы путем щадящего испарения и конденсации растворителя. Растворители превращаются из жидкости в пар и обратно – в жидкость. Испарение происходит при пониженном давлении, что позволяет температуре кипения растворителя оставаться ниже, чем при атмосферном давлении.

Есть несколько возможных результатов процесса дистилляции.
Сушка – это процесс отделения жидкости от твердого вещества. Концентрирование – это процесс, при котором вы испаряете растворитель, оставляя некоторое его количество в пробе.

Лиофильная сушка для концентрирования белков

Лиофильная или сублимационная сушка – это самый щадящий процесс сушки различных видов легко портящихся материалов. Лиофильная сушка основана на сублимации – прямом переходе вещества из твердого в газообразное состояние. Сначала продукт замораживают (стадия замораживания), а затем сушат путем сублимации при пониженном давлении (стадия первичной сушки). Низкое давление позволяет сразу превращать замороженный растворитель в пар, минуя жидкую фазу. Обычно растворителем, который необходимо удалить из продукта, является вода, но другие растворители, такие как ацетонитрил, также могут быть эффективно отделены.

Различия между ротационным упариванием и лиофильной сушкой

Существуют ключевые различия между использованием ротационного упаривания и лиофильной сушки для концентрирования белков. Я обобщил различия в параметрах в таблице ниже:

	Ротационное упаривание	Лиофильная сушка
Приложенное минимальное давление	До 5 мбар	До 0,03 мбар
Диапазон температур	Обычно от 40 до 60 °C	Температура окружающей среды (манифолды или необогреваемые полки)
Конечный продукт	Сухой или концентрированный	Сухой
Подготовка образца	Нет	Да, образец необходимо заморозить

Теперь давайте рассмотрим еще несколько факторов:

1. Подготовка образца для концентрирования белка. Использование системы ротационного упаривания не требует подготовки образца. Если вы решите использовать лиофильную сушилку, до начала процесса вам потребуется заморозить образец. Удобно, что можно использовать специальный сосуд Дьюара, наполненный сухим льдом, и ротационный испаритель, чтобы подготовить образец для лиофильной сушки.

2. Концентрирование воды. Для стадии очистки белков перед стадией концентрирования часто используется обращенно-фазовая хроматография. Для этого метода используется смесь, состоящая из воды со смешивающимся с ней растворителем, таким как метанол, ацетонитрил или этанол. Следовательно, вода является основным растворителем, который необходимо удалить при концентрировании белка. Температура кипения растворителя – это главный параметр, который следует учитывать при ротационном упаривании. Ниже представлена таблица с температурами кипения наиболее распространенных растворителей, используемых в обращенно-фазовой хроматографии:

Растворитель	Точка кипения при атмосферном давлении (в °C)	Скорость отгонки растворителя (в л/ч)
Вода	100	0,75
Метанол	64,7	1,8
Этанол	78,37	1,8

Обратите внимание: ротационное испарение проводили с нагревательной баней при 60 °C, температурой в охлаждающем контуре 20 °C, испарительной колбой объемом 1 л при 280 об/мин.

Как видите, вода имеет гораздо более низкую скорость перегонки по сравнению с метанолом и этанолом на ротационном испарителе. Вода – самый простой растворитель для отделения с помощью лиофильной сушилки. Лиофильная сушка – лучший вариант, если вы хотите отделить воду в больших количествах.

3. Термическое воздействие во время концентрирования белков. И лиофильная сушка, и ротационное упаривание используют пониженное давление, что позволяет сушить при более низких температурах. Лиофильные сушилки позволяют нам работать при температуре окружающей среды, в то время как ротационные испарители часто требуют нагрева до температуры выше температуры окружающей среды.

4. Конечный продукт концентрирования белков. При ротационном упаривании внешний вид конечного продукта зависит от характеристик соединения. Если у вас порошкообразный состав, после ротационного упаривания вы получите порошок с неравномерными частицами. Лиофильная сушка сохраняет продукты в их первоначальной форме, а это означает, что порошковая смесь будет иметь воздушную, похожую на снег форму.

Другие критерии, такие как время, способ ввода образца, бюджет и масштабируемость, также играют роль в выборе наилучшего метода для вашего приложения. Таким образом, рисунок ниже может помочь вам выбрать метод, наиболее подходящий для концентрирования вашего белка:

Я надеюсь, что это сравнение ротационного упаривания и лиофильной сушки помогло вам лучше понять доступные варианты для эффективного концентрирования белка. Кстати, это не первый раз, когда я сравниваю разные возможности в лаборатории. Прочтите один из моих первых и самых любимых постов, в котором я исследую различия между силикагелем и оксидом алюминия для флэш-хроматографии и препаративной ВЭЖХ.

Кто же все-таки победил: байк, роликовые коньки, скутер или лонгборд? Мой племянник выбрал лонгборд: здесь сыграл фактор крутизны. К счастью, факторы крутизны ротационного упаривания и лиофильной сушки для концентрирования вашего белка практически одинаковы. Вы согласны? Оставьте мне комментарий ниже! Ах, и просто чтобы держать вас в тонусе, я уже чувствую, что не исчерпал все, что мне нужно сказать по теме концентрирования белков. Не пропустите следующие публикации, в которых я обязательно раскрою эту тему более подробно.

До новых встреч,