Концентрирование белков и пептидов – такая увлекательная, но сложная задача, что я решил посвятить этой теме еще один пост. Ранее я обсуждал различные доступные методы концентрирования белков. Сегодня я сосредоточусь на советах о том, как оптимизировать процесс ротационного упаривания и лиофильной сушки для концентрирования белков и пептидов. Прочтите эту статью и откройте их для себя.

У меня сейчас отличное настроение, ведь в эту субботу состоится финал Лиги чемпионов! Как вы, возможно, уже знаете из предыдущих сообщений в блоге, я большой фанат футбола, да и вообще спорта. Для просмотра финальной игры я заготовил себе множество закусок, в том числе попкорн для приготовления в микроволновке. Я настраивал свою микроволновую печь, чтобы приготовить попкорн, когда понял, что для разных типов продуктов, которые можно там разогреть, есть разные настройки. У вас есть настройки, оптимизированные для попкорна, пасты, пиццы, напитков, разморозки, овощей и т. д. Один инструмент – множество способов применения.

Как ни странно, почти любое лабораторное оборудование можно сравнить с микроволновой печью. Что я имею в виду? Что ж, все можно настроить, используя параметры, оптимизированные для конкретных применений. Например, то, как вы используете ротационный испаритель Rotavapor® для перегонки ароматизаторов джина, отличается от того, как вы настраиваете его для концентрирования белков. То же самое верно для вашего хроматографа, лиофильной сушилки и большей части вашего лабораторного оборудования.

Я только что разместил пост о концентрировании белков и пептидов с помощью лиофильной сушки и ротационного испарения. Пожалуй, я продолжу эту тему, предложив вам несколько советов и приемов для настройки ротационного испарителя и лиофильной сушилки с наиболее подходящими для концентрирования белков и пептидов параметрами.

Советы по использованию ротационного испарителя для концентрирования белков:

• Оптимизация давления – используйте таблицу растворителей или ротационный испаритель со встроенной библиотекой растворителей, чтобы найти рекомендуемые значения для растворителя, с которым вы работаете. Чтобы избежать резкого вскипания и пенообразования, медленно доводите давление до желаемого заданного значения и поддерживайте его постоянным.

• Следуйте «Правилу дельта 20» – я уже писал о «Правиле дельта» в ротационном испарении. Вкратце, это правило используется в качестве ориентира для достижения компромисса между высокой производительностью испарения и потреблением энергии. Согласно правилу, для концентрирования белков или даже для других целей вы должны установить разницу температур между нагревательной баней и температурой пара, а также пара и охлаждающего контура в 20 °C. Например, если вы используете циркуляционный охладитель при 0 °C, вам необходимо настроить температуру паров на 20 °C, а баню на 40 °C, чтобы эффективно подводить и отводить накопленную энергию.

• Нагружайте свой конденсатор на 75% – оптимальная нагрузка на холодильник составляет 75%, независимо от вашего применения, включая концентрирование белков. При этом значении процесс перегонки находится в равновесии. Другими словами, подводимая энергия для испарения и отвод энергии через конденсатор находятся в равновесии. Чтобы обеспечить нагрузку холодильника на 75%, следите за высотой сконденсированного растворителя на его змеевике.

• Используйте колбу большего размера – колба большего размера имеет большую площадь поверхности, что положительно влияет на эффективность испарения. Удвоение объема испарительной колбы может повысить производительность до 50%, что повысит эффективность концентрирования белков и пептидов.

• Увеличьте скорость вращения – более быстрое вращение значительно увеличивает площадь поверхности, доступную для испарения, а также турбулентность в бане и растворителе. Повышенная турбулентность приводит к более высокой эффективности передачи тепла от нагревательной бани.

• Оптимизируйте процесс вспенивания образцов — белки имеют тенденцию к вспениванию во время ротационного упаривания, что может привести к потере продукта. Чтобы этого не происходило во время концентрирования белков и пептидов, вы можете использовать датчик пены или специализированную стеклянную оснастку. Датчик пены – это оптический датчик, устанавливаемый на холодильнике. Датчик определяет образование пены и автоматически разбивает пену, сбрасывая давление. Стеклянный расширительный блок улавливает любую образующуюся пену в расширительный стеклянный сосуд, предотвращая попадание пены в конденсатор. Расширительный сосуд необходимо очищать после каждого использования.

• Оптимизируйте процесс для порошковых образцов – порошковые образцы, например, во время концентрирования белков, имеют тенденцию прилипать к испарительной колбе, что приводит к потере продукта. Чтобы предотвратить эту проблему, можно использовать специальные сушильные колбы. У таких колб есть выемки, которые уменьшают скопление порошка на стеклянных стенках. Если вам нужна дополнительная информация по этой теме, ознакомьтесь с моими предыдущими постами в блоге оразмерах колб, соответствии толщины стекла и размера колбы и их важности для ротационного упаривания.

Кроме того, при наличии режима сушки, вы можете включить его на своем интерфейсе управления. В этом режиме направление вращения меняется с заданными пользователем интервалами в течение определенного периода времени для улучшения сушки суспензий и повышения эффективности во время концентрирования белков. Для получения дополнительной информации по этой теме ознакомьтесь с моим предыдущим постом о том, как настроить интерфейс.

Советы по использованию лиофильной сушилки для концентрирования белков:

• Сохраняйте короткое расстояние между морозильной камерой и лиофильной сушилкой – для концентрирования белков поместите морозильную камеру и лиофильную сушилку в одном помещении для сокращения времени перемещения образца и поддержания низкой температуры замороженного образца. Если возможно, проведите тест на герметичность вашей сублимационной сушилки, чтобы выявить ошибки конфигурирования и дефекты.

• Увеличьте площадь поверхности продукта – как правило, скорость высыхания продукта зависит от площади поверхности по отношению к объему продукта. Чем больше площадь поверхности, тем быстрее сохнет продукт, так как больше молекул воды может покинуть матрицу. Если вы хотите увеличить поверхность продукта при использовании манифолда для лиофильной сушки при концентрировании белков, я рекомендую использовать поверхностное тонкослойное замораживание, чтобы продукт распределялся по внутренней стенке колбы во время замораживания. Экспериментальные данные показывают, что при тонкослойном замораживании во вращающемся сосуде скорость сублимации оказывается в два раза выше, чем при замораживании в массе. Для получения дополнительной информации прочтите мой предыдущий пост об использовании поверхностного тонкослойного замораживания ускоряющего лиофильную сушку с манифолдом.

• Уменьшите глубину заполнения – поверхность контейнера и глубина заполнения влияют на процесс лиофилизации. Во время лиофильной сушки фронт сублимации перемещается от внешней части образца (граница раздела воздух/твердое тело) к внутренней части, где образец соприкасается с виалой, в результате чего образуется пористый порошок. Скорость движения фронта сублимации зависит от глубины слоя образца. В процессе концентрирования белков методом сублимационной сушки на поверхности замороженного образца постепенно возрастает количество уже высушенного образца. И чем крупнее и толще слой высушенного образца, тем он больше препятствует выходу пара снизу. Это вызывает несколько проблем, включая замедление процесса, влияние на температуру образца или преждевременное плавление образца еще до его высыхания. Чтобы ослабить эти эффекты и улучшить концентрирование белков, я рекомендую увеличить поверхность и уменьшить глубину слоя образца.

• Выберите правильную температуру замораживания – большинство продуктов, подвергающихся лиофильной сушке, состоят из растворителя, такого как вода, и какого-либо образца, растворенного или взвешенного в ней. Температура замерзания такой смеси, зависящая от концентрации белков, определяется ее характеристиками и составом. При охлаждении смеси вода первой отделяется от веществ, поскольку она замерзает в виде льда. В этом случае состав может казаться замороженным, но оставшийся образец при этом может оставаться жидким. Эти образцы образуют концентрированные области, которые в конечном итоге замерзают при температуре ниже точки замерзания воды. Температура, при которой все компоненты смеси будут должным образом заморожены, является максимальной температурой, при которой смесь может выдержать лиофилизацию. Важно отметить, что, если вы применяете вакуум к не полностью замороженной эвтектической смеси, вы можете вызвать разрушение продукта, поскольку незамороженные компоненты расширяются в условиях вакуума.

Надеюсь, вам удалось сохранить концентрацию во время всех этих советов и приемов. Я знаю, что информации много, но я очень надеюсь, что вы сочтете ее полезной для оптимизации концентрирования белков и пептидов. Что до меня, то я пойду готовиться к просмотру футбольного матча. До скорой встречи, любители науки и футбола!

До новых встреч,