Две причины, почему пользователи препаративной ВЭЖХ любят аналитическую хроматографию

Хроматографическая очистка больших количеств химических веществ может оказаться достаточно затратным процессом с точки зрения времени и расходных материалов. Кроме того, при больших загрузках могут возникнуть определенные трудности. Вот почему я обычно рекомендую сначала найти идеальные условия разделения, в том числе правильно выбрать подвижную и неподвижную фазы, с помощью пробного эксперимента. Если вы решили провести препартивную ВЭЖХ, идеальным инструментом для скрининга хроматографических параметров при малых загрузках вещества для вас станет аналитическая хроматография. В этом посте я покажу вам все преимущества этого метода и объясню, как перейти от аналитической хроматографии к препаративной ВЭЖХ.

Моя дочь навестила нас в прошлые выходные и за ужином рассказала о пилотном проекте, над которым сейчас работает. Фактически её рассказ привел нас к мини дискуссии на тему, откуда взялся термин «пилотный проект». Думаю, вам тоже стало любопытно. Очевидно, что термин «пилот» прежде использовали в значении «направлять». Например, пилоты «управляют» самолетами, а «пилотный проект» «направляет» процесс с самых первых стадий. По другому мнению, словосочетание «пилотный проект» могло произойти от понятия «пилотный огонь», т. е. запальник, небольшое пламя, поджигающее большой костер. Без запальника не будет никакого огня.

В любом случае и “пилотные проекты”, и “пилотные эксперименты” очень распространены и в лаборатории. Такого рода эксперименты – это отличный способ быстро и дешево проверить гипотезу перед масштабированием до крупных проектов.

Для флэш-хроматографии, например, я уже рассказывал, как вы можете использовать тонкослойную хроматографию (ТСХ) для подбора подходящих условия разделения, в предыдущем посте нашего блога. В этом случае ТСХ можно считать пилотным проектом.

Но если вы планируете проводить очистку больших количеств веществ с помощью препаративной ВЭЖХ, то эквивалентом ТСХ в данном случае будет аналитическая хроматография.

Аналитическая хроматография способна помочь вам выбрать подвижную и неподвижную фазы и сэкономить при этом время и затраты, а также избежать различных затруднений, возникающих на больших загрузках. Это одна из веских причин полюбить данный метод.

Конечно, для работы с аналитической ВЭЖХ требуется полностью автоматизированное оборудование, что делает данный метод достаточно дорогостоящим. Но в отличие от ТСХ в аналитической хроматографии можно использовать градиенты, что в итоге оказывается выгодным и удобным для пользователя. Фаза C18 (обратная фаза) может помочь повысить экономическую эффективность процесса, поскольку она может использоваться повторно после промывки органическими растворителями и удаления прочно удерживаемых загрязняющих веществ. Тогда как, немодифицированный силикагель нельзя использовать повторно даже после промывки.

При настройке процесса аналитической хроматографии следует выбирать концентрации образцов и скорости потока в соответствии с рекомендациями производителя. Обычно навеска пробы составляет от 1 до 10 мг, а скорость потока находится в диапазоне 0.1–10 мл/мин.

Цель аналитической хроматографии – добиться разделения целевого соединения от примесей вплоть до уровня базовой линии за минимальное время и при максимальной загрузке.

Для проведения аналитической хроматографии выберете сначала подвижную фазу, опираясь на советы из моего соответствующего поста, посвящённого этому вопросу, затем подберите неподвижную фазу, также пользуясь подсказками из специального поста, опубликованного ранее. Для обращенно-фазовой хроматографии часто используют растворители, в состав которых входит вода, смешанная с метанолом, этанолом или ацетонитрилом.

Как только результаты вас удовлетворят, можно приступать к масштабированию до препаративной ВЭЖХ. Всего лишь несколько формул позволят вам перейти от аналитической хроматографии к крупномасштабной очистке. Это вторая причина полюбить данный метод.

Самый простой подход заключается в том, чтобы размер частиц используемого силикагеля и длинна колонки в случае аналитической хроматографии и препаративной ВЭЖХ совпадали. Если у вас есть возможность выполнить эти условия, используйте следующие формулы для расчета загрузки образца (масса, объем или концентрация), скорости потока и диаметра колонки:

Загрузка A = Загрузка B x (Диаметр A/Диаметр B)2 x (Длина A/Длина B)

Скорость потока A = Скорость потока B x (Диаметр A/Диаметр B)2

где A = колонка для препаративной ВЭЖХ
B = колонка для аналитической хроматографии

Чтобы метод был идеален, используйте тот же профиль градиента (соотношение растворителей и времени) и для вашей системы препаративной ВЭЖХ.

Опирайтесь на пример, приведенный в таблице ниже:

	Аналитическая хроматография	Препаративная ВЭЖХ
Внутренний диаметр колонки	4,6 мм	30 мм
Длина колонки	150 мм	150 мм
Размер частиц	5 микрон	5 микрон
Загрузка	0,1 г	4,25 г
Скорость потока	1 мл/мин	42,5 мл/мин
Градиент 10% - 90%	15 мин	15 мин

Я бы также посоветовал вам начать с небольшого флэш-картриджа или колонки для препаративной ВЭЖХ, а при необходимости увеличить масштаб на более позднем этапе.

Если вы хотите узнать ещё больше об этой теме, а также о разработке методов флэш-хроматографии и препаративной ВЭЖХ, то вам действительно повезло. Прямо сейчас вы можете посмотреть запись вебинара по разработке методов хроматографии так что обязательно зарегистрируйтесь по ссылке, чтобы получить бесплатный доступ к записи.

Если вы скорее читатель, чем слушатель, тогда получите доступ к очень ценному и совершенно бесплатному ресурсу Chromapedia (Хромапедия), где вы найдете всю необходимую информацию о методах флэш- и препаративной хроматографии.

Я надеюсь, что этот пост поможет вам успешно выполнять очистку веществ с помощью препаративной ВЭЖХ без лишних потерь времени и ресурсов, что часто случается при разделении больших объемов веществ. Хотели бы вы, чтобы я поподробнее объяснил, как использовать ТСХ для выбора подвижной и неподвижной фаз? Дайте мне знать в комментариях под этим постом! А пока всем пилотам желаю ясного неба над головой.

До новых встреч!